- Posts:
- 4
- Group:
- Members
- Member
- #41
- Joined:
- Jan 31, 2011
|
1.5. Sản xuất Pectinase.
Spoiler: click to toggle Hiện nay, người ta sản xuất pectinase chủ yếu từ VSV. Có hai phương pháp sản xuất pectinase. 1.5.1.Sản xuất chế phẩm pectinase từ canh trường bề mặt.
Spoiler: click to toggle Môi trường sử dụng để nuôi cấy VSV để sản xuất pectinase thường là cám gạo, hay cám mì, bã củ cải hoặc thóc mầm. Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường là các muối ammonium, phosphoric… Độ ẩm môi trường phải nằm trong khoảng 60%. Nấm mốc A.awamori thường được nuôi cấy ở 30oC và trong thời gian 40h, sau đó giảm xuống 24oC và nuôi trong 48-52h. Sản phẩm lên men được sấy khô thành chế phẩm enzyme thô và đem tinh chế. Để thu được chế phẩm pectinase tinh khiết thì chế phẩm enzyme thô phải được trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối ammonium sulfate. Dung môi hữu cơ sử dụng để kết tủa enzyme pectinase có thể là rượu ethanol (72,5-75%) hoặc isopropanol (55-57%). Muối ammonium sulfat sử dụng có độ bảo hoà 0,79. Khi kết tủa bằng rượu ethanol, chế phẩm enzyme thu được có độ tinh khiết khoảng 90%, còn nếu bằng muối thì độ tinh khiết đạt khoảng 75%. Nhiệt độ kết tủa tối ưu với rượu là 2-5oC, thời gian tiếp xúc với rượu càng ngắn càng tốt. Sau đó, ly tâm để tách kết tủa khỏi dung dịch, sấy kết tủa trong thiết bị sấy chân không hay sấy thăng hoa rồi nghiền nhỏ và đem bảo quản. 1.5.2.Sản xuất chế phẩm enzyme từ canh trường bề sâu. 1.5.2.1.Phương pháp hiếu khí.
Spoiler: click to toggle Sự tích tụ enzyme trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của VSV gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị acid hoá mạnh và khi lượng phospho vô cơ được sử dụng hoàn toàn. pH của môi trường nuôi cấy thường đạt từ 6-7,2 là thích hợp. Đối với nấm mốc, pH kiềm kìm hãm sự tổng hợp sinh khối và sự tích lũy enzyme pectinase. pH=4 ức chế hoàn toàn sự tích lũy enzyme pectinase. Khi pH dịch về phía acid, ngay cả khi pH nằm trong khoảng 4,5-5,0, tuy sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzyme pectinase bị kìm hãm. Tuy nhiên, pH của các trường nuôi cấu A. niger và A. awamori 16 có thể dịch về 3,5-3,8 và 2,9-3,2, theo thứ tự. Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32 và 48h tuổi và với hàm lượng từ 2-10%. Đối với A. niger và A. awamori, vật liệu gieo cấy là sợi nấm được ủ sơ bộ trong môi trường dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào tử. Thời gian ủ sơ bộ thường là38-42h. Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2%. Trong quá trình nuôi cấy, hàm lượng các chất hoà tan trong môi trường thường giảm từ 6% xuống còn 1,5-1,8%. Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng. Cô đặc chân không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị sấy phun. Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165-180oC và đi ra đạt 60-70oC. Thời gian lưu của chế phẩm enzyme trong thiết bị sấy phun phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải không quá 40oC. Chế phẩm thu được cần phải được đóng gói kín để tránh hút ẩm. Có thể thu chết phẩm pectinase tinh khiết bằng cách kết tủa enzyme trong dịch lọc canh trường với ethanol theo tỉ lệ 4:1, với aceton theo tỉ lệ 2:1 và isopropanol thưo tỉ lệ 1,3:1, hoặc với muối ammonium sulfate (50-80% trong muối kết). Nếu kết tủa bằng ethanol, hoạt độ pectinase trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-90% so với hoạt độ của dịch canh trường ban đầu. Nếu kết tủa bằng muối ammonium sulfate, cần tách muối ra khỏi enzyme bằng phương pháp thẩm tích (với nước hoặc dung dịch đệm), sau đó sấy khô. Khi độ bão hoà của (NH4)2SO4 bằng 0,5 thì sẽ kết tủa được đoạn có hoạt độ pectinase thấp (đoạn này chiếm 0,25% trọng lượng khô), nhưng nếu kết tủa bằng (NH4)2SO4 có độ bão hoà 1.0 thì sẽ kết tủa được đoạn chỉ chiếm 0,11% nhưng lại có hoạt độ pectinase cao. 1.5.2.2.Phương pháp yếm khí.
Spoiler: click to toggle Môi trường: Bã củ cải:2%; (NH4)2HPO4 0,75%; KH2PO4:0,1%; CaCO3: 0,3%; nước chiết ngô: 0,5% Clostridium pectinopermentants 15 có khả năng tổng hợp pectinase một cách mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời với sự tích lũy sinh khối. Sự tích lũy enzyme sẽ tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 55-60h. pH ban đầu của môi trường dinh dưỡng là 6,5-7,0. Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở dạng canh trường chứa bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích. Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 35oC. Cl. Felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinase. Thành phần môi trường gồm có: Lactose:2%; pectin củ cải:1%; (NH4)2HPO4: 0,4%; K2HPO4: 0,7%; KH2PO4:0,3%; NaCl:0,1%; MgSO4: 0,025%; FeSO4: dạng vết; CaCO3: 0,5%; dịch nấm men tự phân: 0,05%; ascorbic acid: 0,5%. Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa enzyme với dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium sulfate. Nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ, pH của dung dịch đã xử lí là: 6,5-6,8. Nếu kết tủa bằng 2-2,5 thể tích aceton thì hoạt độ của enzyme trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu. Khi kết tủa bằng ammonium sulfate có độ bão hoà bằng 0,2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectinesterase và pectintranseliminase; khi độ bão hoà là 0,9-1 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectintranseliminase và exopolygalacturonase. Phương pháp hiện đại trong chuẩn bị chế phẩm enzyme pectinase thường theo các bước cơ bản sau đây: -Khử muối bằng phương pháp lọc gel(Biogel P100) -Tách protein bằng phương pháp trao đổi anion (DEAE Biogel A), hay trao đổi cation (CM Biogel A) -Tách enzyme pectinase bằng alginate liên kết ngang -Tinh sạch bằng FPLC. Alginate liên kết ngang hoạt động bằng cách kết hợp ái lực, ảnh hưởng tĩnh điện và thay thế pectate liên kết ngang. 1.5.3.Ý nghĩa về mặt kỹ thuật của các endo-enzyme. 1.5.3.1.Pectinesterase.
Spoiler: click to toggle Ethanol có mặt trong phần chưng cất được từ thịt quả lên men là do pectin methylester bị phân cắt bởi endo-enzyme PE. Trong suốt quá trình lên men, ethanol được sinh ra và các đơn vị sản xuất cần phải thanh trùng thịt quả trước khi lên men để nồng độ ethanol có mặt trong sản phẩm không vượt quá giới hạn cho phép. Sự có mặt của PE trong trái cây họ citrus là nguyên nhân gây ra các vấn đề cần được giải quyết trong công nghiệp thực phẩm, tức là sự mất đi của các vết vẫn đục trong dịch ép. Nếu PE không bị ức chế trực tiếp sau khi tách chiết dịch quả bằng cách bất hoạt bởi nhiệt hay làm đông, các phân tử pectin sẽ bị đề ester hoá và sẽ bị đông tụ bởi sự có mặt của các ion Ca++ trong dịch ép. Để ngăn điều này, nước ép được tách thành phần cặn và phần trong. Nếu nước ép quá đặc, gel pectate sẽ được hình thành và do đó nước ép sẽ không được hoàn nguyên lại nữa. Những vấn đề này làm giảm chất lượng sản phẩm một cách nghiêm trọng. Các chất tạo hương của trái cây họ citrus cực kỳ mẫn cảm với nhiệt, vì thế các phương pháp sản xuất sản phẩm trái cây đông lạnh đang rất cần thiết. Phức hợp của ion Ca++ có thể ngăn ngừa sự biến mất của các đám mây vẫn đục do hoạt động của PE, nhưng lại làm phát sinh các vấn đề mang tính chất pháp lý. Polyphenol có thể ức chế hoạt động của PE nhưng lai gây ảnh hưởng đến vấn đề cảm quan, chẳng hạn về vị trí và tính đồng nhất của sản phẩm. PE đồng thời là một chất ức chế sản phẩm cuối, nhưng nếu thêm pectic acid vào lại làm nước ép bị phân lớp, thế là lại tạo ra một vấn đề không mong muốn khác. Tuy nhiên, việc thủy phân pectic acid, đến mức polymer hoá 8-10, có ảnh hưởng ức chế của các chế phẩm polymer cao phân tử nhưng lại không đông tụ với Ca++. Việc thêm các chế phẩm như thế sẽ không ngăn ngừa được nhưng sẽ trì hoãn được quá trình tự phân lớp, có lẽ đủ lâu để phân phối nhanh các loại nước ép trái cây tươi được làm tan giá. Một khả năng khác là việc thêm các exo-enzyme (H.6.10): PG làm phân hủy pectin có mức ester thấp hình thành trước khi sự đông tụ với Ca++ xảy ra, hay PL phân hủy các pectin trong nước ép trái cây đến các sản phẩm có khối lượng phân tử thấp hơn, là các hợp chất không mẫn cảm với Ca++, dù là đề ester hoá và thực tế cũng có thể hiện chức năng ức chế PE. Hoạt động phân hủy pectin bởi enzyme như thế đã được ứng dụng trong việc làm giảm độ nhớt trong nước trái cây, vì thế làm tăng nồng độ của các thành phần chất chiết đến các giá trị Brix cao hơn như bình thường có thể. Cũng cần phải lưu ý việc sử dụng các giai đoạn bay hơi nhiều lần nhằm tối ưu hoá quá trình xử lý nhiệt và khôi phục hương vị sản phẩm, kết hợp với việc bảo quản trong điều kiện đông lạnh và vận chuyển sản phẩm nước ép cô đặc giúp tránh được phần lớn PE bị bất hoạt do tác động của nhiệt độ.Tuy nhiên, đối với các nước đang phát triển, vẫn đang tồn tại vấn đề này trong công nghiệp sản xuất nước ép trái cây họ citrus và các loại nước ép vẩn đục khác có hoạt lực PE cao và các chất tạo hương rất mẫn cảm với nhiệt, chẳng hạn như ổi và xoài. Các PE được phân lập từ cam có hình thức khác nhau và có ái lực khác nhau đối với pectin và pectate. Mặt khác, chúng cũng khác nhau về độ bền nhiệt, và cũng dễ hiểu rằng chúng đóng vai trò khác nhau trong hiện tượng làm trong dịch quả ép. Một loại được phân biệt bởi khối lượng phân tử của nó rất cao, chỉ chiếm khoảng 5% hoạt tính toàn phần và mang một số đặc điểm nổi bật. Loại này bền nhiệt và vì thế đóng vai trò chính yếu trong việc làm trong dịch quả ép đã thanh trùng với lượng nhiệt không đủ. Enzyme này cũng hoạt động ở nhiệt độ thấp và pH thấp và do đó được coi là có vai trò quan trọng trong quá trình tự tách lớp của nước chanh trong và nước ép từ quả chanh thu được bằng cách để lắng nước ép trong tank có chất bảo quản là sulfur dioxide. Những dịch trong từ quả ép như thế vẫn đang là những sản phẩm có giá trị thương mại được sản xuất với việc ứng dụng các chế phẩm pectinase thương mại. Trong số hai isoenzyme trong bảng 6.13, chỉ có isoenzyme PE loại I có khả năng làm tách lớp. PE loại II không có khả năng này; lượng methanol tự do được thoát ra ít hơn so với methanol tạo ra bởi các enzyme tách lớp. Bảng 6 cho thấy khả năng ức chế rất cao của pectate có lẽ đã ức chế sự hoạt động của enzyme ở một mức nhất định trong quá trình ester hoá. Anh hưởng này được tăng lên bởi sự đóng góp của các nhóm acid tạo thành. Hình 6.11 cho thấy, nếu thêm PG vào thì khối pectate lại bị phân hủy tiếp và trên thực tế tốc độ phản ứng mà tại đó methanol tự do hình thành trong nước cam ép có PE hoạt động được tăng lên bởi PG. Các sự khác nhau về mặt động học như thế cũng có thể giải thích tính ức chế không hoàn toàn bởi oligogalacturonate. Một loại PE khác trong nước cam ép không gây ra sự tự phân lớp, thậm chí ngay cả sau khi giải phóng một lượng methanol bằng với lượng methanol mà PE phóng thích. Các kiểu tấn công của enzyme phải được giả định sao đó để pectin với hàm lượng ester thấp được sinh ra mà có tính mẫn cảm với Ca++ giảm đi, có lẽ bởi sự phân bố ngẫu nhiên của các nhóm carboxyl tự do. Cơ chế này thường thấy ở các PE của nấm, chẳng hạn như ở A. japonicus, enzyme này được sử dụng để sản xuất pectin có mức ester hoá thấp dùng trong chế biến mức ít đường. Những pectin như vậy thường được sản xuất nhờ quá trình thủy phân nhờ acid. Pectinesterase của nấm cũng được sử dụng để tách lớp rượu táo Pháp. Hai isoenzyme với đặc tính làm tách lớp nước cam này được tìm thấy trong tất cả các thành phần của quả cam. Có đến 12 loại PE được tìm thấy trong quả cam trồng và các loại quả họ citrus khác và chúng được tách trên cơ sở ái lực của chúng đối với pectate. Điều cần chú ý là hoạt động của các PE bị ức chế bởi nồng độ cao của đường để tạo nước ép cô đặc đến 60oBx, tại đó các enzyme này không hoạt động nhưng lại có thể hoạt động sau khi hoàn nguyên (pha loãng trong nước). Hiện tượng đông tụ với calcium của pectin bị đề ester hoá bởi PE được khai thác khi sấy khô vỏ trái cây họ citrus sau khi ép làm thức ăn cho gia súc. Chất vữa calcium hydroxide được thêm vào khối vỏ trong khi nghiền để đưa pH ve giá trị trung tính hay cao hơn. pH cao, và nồng độ ion Ca++ cao, làm kích hoạt PE, quá trình đề ester hoá xảy ra nhanh và sự đông tụ của pectate với calcium xảy ra. Chất lỏng được tiết ra và được ép, để chỉ có một phần ít nước còn lại cần được loại bỏ nhờ quá trình sấy bởi nhiệt. Phần nước ép có thành phần tương tự như nước ép từ quả được cô thành mật và cũng được làm thức ăn cho gia súc. Dĩ nhiên, vỏ trái cây họ citrus khô được sử dụng làm nguyên liệu thô để trích chiết pectin, do đó cần phải ngăn chăn hoạt tính của PE bằng cách tẩy trắng vỏ ngay lập tức, nếu không, pectin được chiết ra, cho dù bị đề ester hoá ít thôi, sẽ chứa các khối galacturonic acid tự do và sẽ rất mẫn cảm với Ca++ và vì vậy không sử dụng được để làm yếu tố tạo đông. Endo-PE cũng được khai thác để bảo vệ và cải tạo kết cấu và độ chắc của nhiều loại rau quả chế biến, như táo cắt lát, cà chua đóng hộp, súp lơ, cà rốt, khoai tây và đậu. Quá trình làm trắng ở nhiệt độ thấp, thời gian dài kích hoạt PE, làm cho pectin bị đề ester hoá một phần, sau đó pectin bị đề ester hoá này phản ứng với Ca++, tạo nên sự kết dính nội bào mạnh hơn. Sự kích thích mạnh hơn đối với PG và mạnh hơn trong thí nghiệm b, trong đó enzyme, esterase bị ức chế mạnh hơn bởi sản phẩm cuối so với trong thí nghiệm a. Rõ ràng PL (----) không phân hủy được các vùng ức chế đề ester hoá nên không có ảnh hưởng gì. 1.5.3.2.Pectinesterase và polygalacturonase.
Spoiler: click to toggle Hai enzyme này có mặt cùng nhau rất nhiều trong cà chua, có ảnh hưởng rất lớn trong quá trình chế biến cà chua. Việc gây bất hoạt các enzyme này bởi nhiệt ngay lập tức là cần thiết để có được nước ép có độ nhớt cao như người tiêu dùng mong muốn hay nước ép dạng paste, sử dụng làm nước chấm, soup, nước sốt cà chua nấm và một số sản phẩm tương tự. Những loại nước quả này được xử lý nhiệt trong một thiết bị đặc biệt mà trong đó cà chua được nghiền trực tiếp thành cà chua nóng dạng nhão. Rõ ràng, quá trình xử lý nhiệt tạo ra một số các hương vị đặc trưng cho sản phẩm cà chua chế biến. Trong trường hợp các thành phần cà chua được sử dụng để tạo màu và hương vị, còn phần chính của sản phẩm là do các thành phần khác, như tinh bột tạo nên thì nguyên liệu nước ép phải ở trạng thái nguội hơn, đồng thời phải có một thời gian nghỉ giữa hai giai đoạn nghiền ép và xử lý nhiệt để pectin có thể bị phân hủy nhiều hơn nhờ tác động kết hợp của PG và PE. Còn trong những trái cà chua được cải tạo gen để giảm hàm lượng PG, phần rắn và độ chắc cũng như độ nhớt của quả được tăng lên. 1.5.3.3.Hoạt tính pectinase từ nguồn VSV gây nhiễm.
Spoiler: click to toggle PG từ nấm men và PAL từ vi khuẩn cùng với các endo-PE đều có liên quan đến quá trình làm chín dưa chuột và ô liu ngâm trong nước muối. Sự hao hụt về chất lượng này có thể tránh được bằng cách sử dụng các chất ức chế, chẳng hạn như các polyphenol rò rỉ ra từ lá nho vào trong nước muối. Nước muối có thể được sử dụng để thanh trùng nấm mốc bền nhiệt Byssochlamys fulva. Nấm mốc này sinh enzyme làm hỏng dâu tây trong sirô (syrup) hay mứt. Một loại PG bền nhiệt có từ loài Rhizobium có thể làm hỏng kết cấu của thịt quả mơ đóng hộp. Sự nhiễm nấm có thể gây ra hiện tượng tách lớp của nước cam vô khuẩn và đã đóng chai, không rõ là do tác động của PE, PG hay cả hai, nhưng một lượng lớn methanol tự do được tìm thấy trong loại nước quả phân lớp này. PG nấm men có thể phân hủy pectin trong quá trình lên men bột táo nghiền, làm cho bã táo bị mất đi một lượng lớn pectin nếu được đem làm nguyên liệu thô để sản xuất pectin. Lên men cà phê và cacao là một lĩnh vực ứng dụng nhiều triển vọng của enzyme pectinase có từ nguồn VSV. Trong quá trình len men, lớp chất nhầy xung quanh các hạt này bị phân hủy nhanh hơn và bị rửa khỏi hạt trước khi hạt được sấy khô. Một ứng dụng khác là sự tạo hương đặc biệt cho sản phẩm rượu do sự hình thành các sản phẩm trao đổi chất của nấm mốc nhiễm vào trái nho chín có hàm lượng đường cao bằng cách đâm thủng vỏ trái nho và để nước trong nho bay hơi, và để nho bị nhiễm nấm.
|