Quá trình sản xuất acid citric bằng phương pháp lên men có thể chia ra ba giai đoạn sau:
-Chuẩn bị dung dịch lên men
-Lên men
-Xử lý dịch đã lên men để thu acid citric.
a)Chuẩn bị dịch lên men:Nguyên liệu chủ yếu để lên men citric là đường. Ngoài ra N2, P, S, Zn, Fe và Mg cũng là những thành phần rất quan trọng của môi trường lên men. Người ta đã chứng tỏ rằng hiệu suất của acid citric sẽ cao khi màng nấm mỏng và khi có hình thành bào tử nhưng rất yếu. Và điều đó thường xảy ra khi hàm lượng muối trong môi trường là cực tiểu.
Nitơ là thành phần quan trọng nhất thường được đưa vào môi trường lên men dưới dạng NH4Cl, NH4NO3. Hiệu suất của quá trình lên men là cực đại nếu hàm lượng nitơ có trong dịch lên men là 0,07%.
Phospho cũng là nguyên tố rất quan trọng. Thiếu P, hệ sợi nấm tạo thành yếu và sẽ thiên về tổng hợp ra acid gluconic. Còn khi không có P thì hệ sợi nấm lại không phát triển. Thường hàm lượng P2O5 khoảng 0,016 – 0,021% là thích hợp để cho hiệu suất cao.
Lưu huỳnh thường được đưa vào môi trường lên men dưới dạng muối magie sulfat, kẽm sulfat và sắt sulfat. Lượng S thích hợp là 71,1ml/l. tăng lượng S cao hơn sẽ giảm khả năng tổng hợp acid citric của hệ sợi.
Các nguyên tố khác như Mg, Zn, và Fe cũng không kém quan trọng. Loại trừ Zn ra khỏi môi trường thì hầu như không tổng hợp ra được acid citric. Hiệu suất của acid citric sẽ rất cao nếu như Zn, Fe, Mg có mặt với hàm lượng giới hạn.
Như vậy các nguyên tố vô cơ là nhân tố điều chỉnh sự tân tạo acid citric rất quan trọng.
Trong các đường làm nguyên liệu thì saccharose (chứa trong rỉ đường) và glucoza kỹ thuật là tốt hơn cả. Đường củ cải tạo điều kiện cho hệ sợi nấm sinh trưởng tốt và hiệu suất acid cao. Hiệu suất acid cực đại khi nồng độ đường trong dịch lên men tương đối lớn (25%). Nồng độ đường cao hơn, quá trình lên men bị ức chế. Khi hết glucid thì hệ sợi nấm bắt đầu sử dụng đến acid citric. Khi đó phần lớn (85%) acid được hệ sợi dùng cho hô hấp:
b/ Lên men:Trong giai đoạn lên men acid citric thì độ pH, nhiệt độ và độ thoáng khí có ý nghĩa rất quan trọng.
Để cho hệ sợi nấm tạo acid sinh trưởng và hình thành dung dịch phải được acid hóa bằng HCl đến pH 3 - 4, pH tối ưu còn phụ thuộc vào dạng nitơ có trong dung dịch. Nếu nitơ ở dạng NH4NO3 thì pH tối ưu xấp xỉ 3, còn nếu ở dạng NH4Cl thì pH tối ưu gần 4. Trong quá trình lên men do sự tạo hành liên tục acid citric nên pH của dung dịch lên men giảm xuống 2,4. Như vậy, dung dịch có pH tối ưu chỉ trong thời kì sinh trưởng của nấm.
Sự thoáng khí của môi trường lên men có ý nghĩa quan trọng trong sản xuất, vì tất cả nấm mốc có hệ sợi đều là cơ thể hiếu khí điển hình. Sự tổng hợp nên các sản phẩm oxy hóa khác nhau là nhờ các sản phẩm của sự phân ly mạch carbon của glucid. Các phản ứng phân giải đầu tiên không phụ thuộc vào sự có mặt của oxy không khí. Còn các phản ứng phân giải thứ đến là những phản ứng oxy hóa có oxy phân tử tham gia. Nấm mốc cần một lượng oxy lớn trong thời gian phát triển của mình. Sự thoáng khí được thực hiện bằng cách thông gió cho buồng lên men.
Oxy khi có nồng độ vuợt quá hàm lượng bình thường của nó trong không khí (21%) sẽ làm chậm sự sinh trưởng của nấm mốc nhưng lại kích thích sự sinh tổng hợp acid citric. Còn khi không khí có oxy kéo dài, hệ sợi sẽ nấm sẽ bị chết. Như vậy lượng không khí nhiều hay ít đều không thuận lợi cho sự lên men citric. Oxy cần cho sự hô hấp và cho sự tổng hợp acid citric.
Nhiệt độ có ảnh hưởng đến cường độ sinh trưởng và tạo acid của nấm mốc. Nhiệt độ tối ưu do tính chất của vi sinh vật cũng như do yêu cầu trong các giai đoạn của chu trình sản xuất quyết định. Nhiệt độ thấp hơn sẽ tạo ra acid gluconic, nhiệt độ cao hơn sẽ ngừng quá trình tạo ra acid citric.
Có thể lên men bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt hoặc bằng phương pháp nuôi cấy chiều sâu.
c/ Xử lý dịch đã lên menDung dịch đã lên men là một hỗn hợp các acid limonic, acid gluconic, acid oxalic, đường chưa bị lên men và các tạp chất vô cơ (trong đó acid citric 40 – 50g/l, acid gluconic 3g/l, acid oxalic 1g/l, đường chưa lên men 70g/l).
Trung hòa dung dịch bằng phấn. Dựa vào độ hòa tan khác nhau của các muối tạo thành để tách muối canxi citrat. Citrat hòa tan ít trong nước sôi, nhưng hòa tan trong nước lạnh, canxi oxalat không hòa tan, còn canxi gluconat thì hòa tan ở bất kì nhiệt độ nào. Lọc để tách kết tủa canxi citrat ra.
Phân ly canxi citrat bằng acid sulfuric để tạo ra acid citric. Cô đặc và kết tinh acid citric .
Hiện nay vẫn tồn tại hai phương pháp sản xuất acid citric từ nấm sợi Aspergillus niger: phương pháp lên men bề mặt và phương pháp lên men chìm.
a/ Phương pháp lên men bề mặt:Phương pháp lên men bề mặt ứng dụng nhiều vào những năm đầu của thế kỷ XX, theo đó các vi sinh vật phát triển hẳn trên bề mặt môi trường nằm giữa pha rắn và pha khí hoặc nằm giữu pha lỏng và pha khí.
Như vậy, phương pháp lên men bề mặt có thể sử dụng hai loại môi trường: môi trường bán rắn, còn gọi là môi trường xốp và môi trường lỏng.
Lên men bề mặt với môi trường bán rắn:
Phương pháp này ít được áp dụng vì hiệu suất thu không cao và khá phức tạp ở khâu chiết, tách acid citric.
Trước kia người ta dùng môi trường cám mì, cám gạo có trộn khoảng 15 - 25% trấu để tăng độ xốp của môi trường. Ngoài ra, trong một số cơ sở người ta còn dùng môi trường khác từ sắn, khoai tây, bắp…
Môi trường làm nguyên liệu phải được nghiền nhỏ đến kích thước vừa phải. Sau khi nghiền xong môi trường phải được làm ấm đến độ ẩm khoảng 60 - 65% và đem hấp thanh trùng bằng hơi nóng. Môi trường làm xong phải được làm nguội và chuẩn bị cho quá trình nuôi cấy.
Trước đó ta phải chuẩn bị giống. Quá trình này còn gọi là giai đoạn thu nhận bào tử giống.
Có 2 phương pháp thu nhận:
-Phương pháp thứ nhất
Chuẩn bị 3 - 4 bình tam giác dung tích 150 ml, cho vào đó khoảng 50g cám để có độ ẩm 60%. Hấp thanh trùng và để nguội.
Từ ống giống Aspergillus niger gốc, ta chuyển toàn bộ khuẩn lạc bằng cách cho vào mỗi ống nghiệm 10ml nước vô trùng, khuấy đều cho bào tử giống trong ống nghiệm hòa trộn trong nước. Bằng phương pháp vô trùng chuyển toàn bộ sang các bình tam giác đã chuẩn bị môi trường sẵn. Lắc đều cho môi trường trộn đều bào tử. Nuôi chúng trong tủ ấm có nhiệt độ 30 - 37
oC, trong thời gian 3 ngày. Khi thấy trong bình tam giác toàn là bào tử màu đen là kết thúc giai đoạn nuôi cấy.
Tiếp đó, cũng môi trường như trên nhưng được chuẩn bị vào khay nhôm hoặc inox. Tải đều khi cho 10% môi trường giống từ bình tam giác đã nuôi ở trên vào. Chiều dày khối trộn khoảng tử 3 - 5cm. Để trong phòng có nhiệt độ ổn định là 32
oC. Nuôi trong khoảng 3 - 4 ngày khi bào tử màu đen xuất hiện kín bề mặt môi trường, đem sấy ở nhiệt độ < 40
oC ta thu được giống bào tử sẵn sàng cho quá trình sản xuất đại trà.
-Phương pháp thứ 2
Người ta nuôi trong môi trường lỏng giống Aspergillus niger. Môi trường để thu nhận bào tử có thành phần như sau:
Dung dịch nước malt có nồng độ chất khô 3 - 5%.
NH4Cl : 0,25g
KH2PO4 : 1,25g
MgSO4: 0,25g
FeSO4 : 0,0125g
Môi trường đã chuẩn bị xong được đưa vào bình có dung tích 2 - 3lít với chiều cao của dung dịch trong các bình là 1cm, đem hấp thanh trùng ở 1 at trong 30phút. Sau đó chuyển giống từ ống nghiệm giống vào. Tiến hành nuôi ở nhiệt độ 32
oC trong thời gian 4 ngày hoặc lâu hơn cho đến khi trên bề mặt xuất hiện váng nấm sợi, lúc đầu là màu trắng sau đó là đen chứa toàn bào tử. Người ta thu bào tử này đem sấy ở nhiệt độ < 40
oC và dùng nó như bào tử giống cấp 1.
Để sản xuất bào tử giống cấp 2,3, người ta thực hiện như quá trình nuôi nấm sợi trên khay đã trình bày ở trên.
Quá trình lên men bề mặt được thực hiện như sau:
Trộn cám với nước theo tỷ lệ 1:1. Hấp thanh trùng ở 1at trong 30 phút và tãi đều ra khay, sau khi làm nguội sẽ được trộn giống với tỷ lệ 0,3 - 0,5%. Chiều dày của khối cám + bào tử giống khoảng 3 - 5cm. Tiến hành nuôi ở nhiệt độ ổn định là 30 - 32
oC trong 4 - 5 ngày. Thời gian lên men kết thúc khi bào tử nấm sợi mới bắt đầu xuất hiện nhiều nhưng chưa hoàn toàn chuyển qua màu đen.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt để thu nhận acid citric trên môi trường bán rắn hiện nay không còn áp dụng ở các nước châu Au nữa. Tuy nhiên, ở nhiều nước vẫn phương pháp này vẫn còn được áp dụng và thay cám bằng bột khoai mì. Cứ 3 – 4kg bột khoai mì người ta thu được 1kg acid citric.
Lên men theo phương pháp bề mặt trên môi trường lỏng:
Trong phương pháp nuôi cấy này người ta sử dụng một trong những công thức môi trường sau đây:
- Môi trường 1:
Saccharose: 150g(15%)
MgSO
4 : 0,25g(0,025%)
KH
2PO
4: 0,5g(0,05%)
Nước 1000ml( thêm vào vừa đủ 100%)
- Môi trường 2: (môi trường Curie)
Saccharose : 12-15%
MgSO
4: 0,15%
KH
2PO
4: 0,1%
NH
4NO
3: 0,2%
pH = 3-3,6
- Môi trường 3: (môi trường Deolger)
Saccharose : 14%
MgSO
4: 0,023%
K
2HPO
4: 0,1%
NH
4NO
3: 0,223%
pH = 2,2
- Môi trường 4
Saccharose: 10%
NH
4NO
3: 0,25%
KH
2PO
4: 0,01%
MgSO
4.7H
2O: 0,03%
ZnSO
4.7H
2O: 0,0008%
pH = 5,5-6
Người ta thay đường bằng mật rỉ. Mật rỉ sử dụng trước khi làm môi trường. Xử lý mật rỉ gồm 3 vấn đề cần giải quyết:
-Xử lý màu
-Xử lý hệ keo có trong mật rỉ
-Xử lý sắt nếu mật rỉ chứa sắt.
Mật rỉ đường cần phải được xử lý màu và hệ keo bằng cách cho dịch qua than họat tính để hấp phụ và pha loãng để điều chỉnh hệ keo của dịch mật rỉ. Nếu trong mật rỉ có Fe3+ người ta cho vào mật rỉ sau pha loãng K4{Fe(CN)6}

Tiếp theo ta hiệu chỉnh hàm lượng đường và pH để thuận lợi cho quá trình lên men. Hàm lượng đường được hiệu chỉnh ở hàm lượng từ 14 - 15% về khối lượng.
Ngoài ra để quá trình lên men thuận lợi cho vi sinh vật người ta bổ sung MgSO
4, NH
4NO
3, KH
2PO
4 và điều chỉnh pH từ 2,2 - 6 tùy thuộc vào thành phần các chất bổ sung mà điều chỉnh pH cho hợp lý.
Quá trình chuẩn bị giống đã được trình bày ở mục trên.
Môi trường lên men phải được lọc ky và thanh trùng, làm nguội, phân phối vào các khay, nuôi ở nhiệt độ 28 - 32
oC trong thời gian từ 48 - 72 giờ. Quá trình lên men trên bề mặt của dịch lỏng nhờ lớp váng dày ở trên đó là khuẩn lạc của nấm Aspergillus niger.
Acid citric sẽ được thẩm thấu qua màng tế bào vào môi trường. Kết thúc quá trình lên men, người ta lấy phần dịch lên men đem đi lọc để thu acid citric và tiếp tục lên men mẻ mới.
b)Lên men theo phương pháp chìm:Trong công nghệ sản xuất acid citric theo phương pháp chìm, người ta sử dụng môi trường giống như môi trường lỏng dùng trong phương pháp lên men bề mặt.
Quá trình được thực hiện trong các thiết bị lên men có cánh khuấy và có hệ thống thổi khí liên tục. Người ta tiến hành lên men ở 28 – 32
oC trong thời gian 6 – 7 ngày.
Trong qúa trình lên men, người ta thường phải sử dụng CaCO
3 để điều chỉnh pH vì acid citric được tạo thành sẽ làm giảm pH xuống 1 – 1,5. Việc điều chỉnh này còn có ý nghĩa là người ta chuyển acid citric thanh xitrat canxi lắng xuống.
Kết thúc quá trình lên men, người ta sử dụng H
2SO
4 để tách acid citric ra. Tiến hành cô đặc và kết tinh acid citric.