- Posts:
- 16
- Group:
- DHTP6LT
- Member
- #365
- Joined:
- Jul 19, 2011
|
1.SACCHARIN (E954) 1.1. Phương pháp định tính
Spoiler: click to toggle Chuẩn bị mẫu thử (a) Đồ uống không cồn Hút khoảng 25 ml mẫu vào máy tách, thêm 3 ml HCl. Nếu trong mẫu có vanillin thì loại bỏ chúng bằng cách trích ly với ete dầu khí. Loại bỏ ete dầu khí. Trích ly tiếp với 50ml, gồm 25ml ete diethyl và 25 ml ete dầu khí (1 +1) và rửa các hỗn hợp trích ly đó với 5 ml H2O, sau đó làm bay hơi các dung môi. (b) Các mẫu bán rắn Chuyển 25 g mẫu vào bình định mức 100 ml và thêm nước cất đến khoảng 75 ml, lắc đều, để hỗn hợp đứng yên một giờ. Sau đó, thêm 3 ml axit axetic, lắc đều, thêm khoảng 5 ml chì axetat Pb(CH3COO)2.3H2O trung tính 20%, thêm nước cất đến vạch định mức, để yên trong 20 phút và sau đó đem lọc. Chuyển 50 ml dịch lọc vào máy tách và tiến hành tương tự (a).
Phát hiện saccharin (a) Bằng cách chuyển đổi thành acid salicylic Hòa tan hỗn hợp sau khi bay hơi dung môi vào 10 ml nước nóng, thêm 2 ml H2SO4. Đun sôi, sau đó thêm một lượng nhỏ dung dich KMnO4 5%. Hoà tan thêm khoảng 1g NaOH rồi đem lọc vào chén nung (có nắp đậy). Làm bay hơi đến khô ở nhiệt độ 210 - 215 ºC trong 20 phút. Sau đó hòa tan hỗn hợp trong nước nóng, axit hóa với HCl và thêm một vài giọt dung dịch FeCI3 trung tính (0,5%). Dung dịch có màu tím chứng tỏ trong đó có axit salicylic (được hình thành từ saccharin). Phương pháp này được gọi là saccharin giả và chỉ 5 mg / lít thì saccharin được phát hiện. (b) Bằng thuốc thử axit Phenolsulphuric Hợp chất thu được sau khi loại bỏ dung môi, thêm 5 ml thuốc thử phenolsulphuric (tinh thể tinh khiết không màu hòa tan trong một lượng tương đương H2SO4) và đun nóng trong 2 giờ tại 135-140ºC. Hòa tan với lượng nhỏ nước nóng và kiềm hoá với dung dịch NaOH 10%. Dung dịch sẽ có màu đỏ tía nếu có sự hiện diện của saccharin. (c) Bằng thuốc thử axit resorcinol sulfuric Hợp chất sau khi bay hơi dung môi thêm 5 giọt acid resorcinol-sulfuric (1:1) và đun nhỏ lửa cho đến khi dung dịch chuyển sang màu đỏ. Hòa tan trong 10 ml nước và kiềm hoá bằng dung dịch NaOH 10% và thêm vài giọt dung dịch i-ốt. Dung dịch sẽ có màu xanh lá cây nếu có sự hiện diện của saccharin.
1.2. Phương pháp định lượng
Spoiler: click to toggle A. Phương pháp chung cho đồ uống không cồn Nguyên tắc Saccharin được trích ly từ một lượng mẫu axit hóa với diethyl ete. Các dung môi được loại bỏ và dung dịch còn lại được đồng hoá với HCl, sau đó được xử lý bằng thuốc thử Nessler và đo độ hấp thụ màu của sản phẩm ở bước sóng 425 nm. Thuốc thử (i) HCl (ii) Diethyl ete (iii) Thuốc thử Nessler: Hòa tan 100g HgI2 và 70g KI trong một ít nước, thêm từ từ vào dung dịch này 160g NaOH hòa tan trong 500 ml nước, khuấy liên tục và pha loãng thành 1 lít. (iv) Nước cất (không có NH3) (v) Dung dịch chuẩn: Hoà tan 0,2921 g NH4Cl trong 1 lít nước cất (tương đương với 1g saccharin trong 1 lít nước). Pha loãng để được dung dịch tương đương 200 mg/ml saccharin. Quy trình Thêm 2 ml HCl vào 50g mẫu. Trích ly với 50 ml diethyl ete (3 lần). Lọc dung dịch trích ly vào bình tam giác 250 ml sạch và làm bay hơi dung môi.Thêm 6 ml HCl và 5 ml nước cất và bay hơi khoảng 1 ml trong chậu nước nóng. Một lần nữa thêm 6 ml HCl và 5 ml nước và bay hơi 1 ml. Pha loãng dung dịch thành 50 ml với nước cất. Hút 2 ml dung dịch này vào bình định mức 25 ml, thêm 1 ml thuốc thử Nessler và dùng nước cất định mức tới vạch. Tương tự hút 0.5, 1, 2, 3 và 4 ml dung dịch chuẩn (200 mg/ml) vào bình định mức 25 ml và tạo màu với thuốc thử Nessler. Đọc độ hấp thụ của mẫu tại bước sóng 425 nm.Từ đó tính hàm lượng saccharin trong mẫu từ đồ thị hiệu chuẩn.
B. Phương pháp đo màu Phenol-H2SO4 Nguyên tắc Saccharin được trích ly từ mẫu axit hóa với chloroform và benzene sau đó làm bay hơi dung môi. Dung dịch thu được xử lý với phenol-H2SO4 và đun nóng ở 175 oC trong 2 giờ. Sau đó kiềm hoá với NaOH và đem đo độ hấp thụ tại bước sóng 558 nm. Thuốc thử (i) CHCl3 (ii) Ether (iii) Chloroform + Benzen (95+5) (iv) Methanol (v) Phenol (tinh thể không màu) (vi) H2SO4 (vii) Dung dich chuẩn Saccharin Chuẩn bị mẫu (a) Nước giải khát (đồ uống có ga và các đồ uống có lượng calo thấp) Loại bỏ CO2 của nước giải khát bằng cách lắc liên tục và đổ nhanh từ cốc này sang cốc khác, lặp đi lặp lại nhiều lần. Chuyển 10 ml mẫu đến bình tách lỏng125 ml có khoá Teflon. Thêm 15 ml nước và 0,5 ml NaOH 1N. Trích ly với 50ml hỗn hợp benzen chloroform. Để cho tách lớp và loại bỏ các lớp dung môi (axit benzoic và benzoates không ảnh hưởng). (b) Nước ép trái cây Chuyển 50 ml mẫu vào bình định mức 100 ml. Thêm dung dịch chì acetate trung tính 5% (<10 ml). Pha loãng đến vạch định mức bằng nước cất, để yên trong 1 giờ và lọc. Dịch lọc có chứa khoảng 1-3 mg saccharin và tiến hành như trong phần “cách xác định” bắt đầu từ "thêm 5 ml HCl và trích ly với hỗn hợp chloroform benzen ". (c) Kẹo ngọt và chất lỏng cô đặc Nghiền 10-20 viên kẹo thành bột mịn. Cân chính xác 0,5 gram bột hoặc hút 10 ml mẫu chất lỏng cô đặc vào bình định mức 500 ml và pha loãng đến vạch định mức bằng nước cất. Lấy 10-15 ml dung dịch đem phân tích. Nếu chất lỏng cô đặc chứa chất bảo quản parabens, thì axit hóa bằng cách thêm 5 ml HCl và trích ly với 20 ml CCl4. Loại bỏ CCl4 và tiến hành như trong phần “cách xác định” bắt đầu từ "trích ly bằng cách lắc 1 phút mỗi lần". (d) Nước quả nấu đông (rau câu) Cân 25 g mẫu vào cốc thủy tinh. Đun nóng trong nước cất để tạo thành dung dịch mẫu. Chuyển sang bình định mức 250 ml, tráng cốc bằng 25 ml nước nóng. Pha loãng với methanol và trộn đều. Để yên trong 1 phút và lọc. Chuyển dịch lọc chứa khoảng 1-3 mg saccharin vào cốc thủy tinh 50 ml. Bay hơi 1/2 thể tích để loại bỏ rượu và chuyển đến bình tách lỏng 125 ml. Tiến hành như trong phần “cách xác định” bắt đầu từ "thêm 5 ml HCl và trích ly với hỗn hợp chloroform, benzen ". (e) Bột protein cao calo thấp, hạt Nghiền hạt trong cối để tạo thành bột mịn. Cân chính xác 10-20 g bột vào bình định mức 250 ml và thêm 150 ml nước nóng. Trộn đều để hòa tan. Thêm dung dịch Pb(OAC)2 trung tính 5% (30 ml). Pha loãng đến vạch định mức bằng nước cất. Lắc đều và để yên 1 giờ. Lấy 50 ml dịch lọc và tiến hành tương tự như trong phần “cách xác định” bắt đầu từ "thêm 5 ml HCl và trích ly với ether, benzen". (f) Thanh Sô cô la Làm nhỏ mẫu và cân 25 g vào cốc thủy tinh. Thêm 150 ml nước nóng và trộn bằng máy khuấy từ để nhũ hóa. Thêm dung dịch Pb(OAC)]2 trung tính 5% (30 ml). Chuyển vào bình định mức 250 ml và pha loãng đến vạch bằng nước cất. Lắc đều, để yên trong 1 giờ và lọc. Sử dụng 50 ml dich lọc tiến hành giống trong phần “cách xác định” bắt đầu từ " thêm 5 ml HCl và trích ly với ether, benzen ".
Cách xác định -Chuyển dich lọc của mẫu đã chuẩn bị, dung dịch chuẩn (1-3 mg saccharin) đã làm ở trên vào bình tách lỏng. Thêm 5 ml HCl và trích ly bằng cách lắc một phút. Mỗi lần với 50, 30 và 20 ml hỗn hợp dung môi chloroform – benzen (95 +5) hoặc với ether: benzen (95 +5) theo quy định trong mẫu chuẩn bị. Lọc dung dịch này qua phễu vào bình định mức 100 ml. Pha loãng đến vạch định mức với hỗn hợp dung môi được sử dụng ở trên và lắc đều. Sau đó chuyển 20 ml vào bình tam giác 50 ml. Bay hơi dung môi đến khô trong chậu nước nóng và làm khô hoàn toàn trong lò 100 ºC trong 20 phút. Dùng pipet hút 1 - 5 ml phenol nóng chảy vào bình tam giác và lắc cho đến khi hỗn hợp sau bay hơi hòa tan. Thêm 1,2 ml H2SO4, lắc và xoay đều. -Đậy chặt bình, bao bằng lá nhôm và đun trong 2 giờ ở 175 oC trong lò. Để nguội và thêm khoảng 30 ml nước nóng vào và lắc đều. Thêm 10 ml dung dịch NaOH 20% và lắc đều. Chuyển dung dịch đó vào bình định mức 100ml và pha loãng đến vạch. Đọc độ hấp thụ của dung dịch trong máy đo quang phổ ở bước sóng 558 nm. Xác định nồng độ bằng cách so sánh với đường cong hiệu chuẩn.
2. ASPARTAME (E951) 2.1. Phương pháp định tính
Spoiler: click to toggle Phát hiện và xác định aspartame bằng phương pháp Sắc ký bản mỏng - TLC Nguyên tắc Aspartame được trích ly từ bột nước giải khát khô bằng cách sử dụng methanol:acetic acid (80:20) và được tách ra bởi TLC. Thuốc thử (i) Methanol: acetic acid (80: 20) (ii) Dung dịch stock Aspartame : Hòa tan 50mg aspartame chuẩn vào khoảng 80 ml dung dịch (i) và định mức thành 100 ml. (iii) Dung dịch chuẩn: Pha loãng 1 ml dung dịch stock với dung dịch (i) trong bình định mức 10 ml. Lặp lại với 8 bình khác, với mỗi bình tăng thêm 1 ml dung dịch stock, thu được 9 bình dung dịch chuẩn có chứa 1-9 ml dung dich stock. Các bình chuẩn sẽ chứa từ 0.05 đến 0.45 μg aspartame / μl. (iv) Dung dịch tinh bột: Hoà tan 600 mg tinh bột trong 120 ml nước, đun sôi trong 10 phút và lọc qua giấy lọc. (v) Potassium iodide / dung dịch tinh bột: Hòa tan 500 mg kali iodide trong 100 ml dung dịch tinh bột (iv). (vi) Các dung môi: Methanol: acetic acid băng: nước: chloroform (60: 4: 12: 128). (vii) Binh Tet-butylhypochlorite (viii) Silica gel G. Chuẩn bị mẫu (a) Bột khô Trích ly aspartame từ bột khô bằng cách lắc với 100 ml dung dịch (i) trong 20 phút. Lượng mẫu sử dụng phụ thuộc vào hàm lượng aspartame lý thuyết có trong mẫu. (b) Chất lỏng Xử lý chất lỏng như phần (a), bỏ việc trích ly với 100 ml dung dịch (I). Quy trình -Dùng micro pipette chấm 2 μl dung dịch mẫu và tiêu chuẩn lên bản sắc kí và sử dụng một luồng không khí mát để sấy khô (tạo thành vết). Đặt bản sắc kí vào trong một bình triển khai (thường bằng thuỷ tinh trong suốt và có nắp đậy kín) và cho dung môi di chuyển lên bản sắc kí khoảng 15 cm để chạy sắc kí. Bỏ bản sắc kí ra và để khô tự nhiên trong 15 phút. Đặt bản sắc kí vào trong bình tertbutylhypochlorite trong 15 phút và để khô trong 30 phút. Phun dung dich KI-tinh bột vào bản sắc kí và tính hàm lượng aspartame của mẫu bằng cách so sánh với các vết chuẩn. -Lưu ý: Tert-butylphyochlorite là một chất độc khi hấp thụ qua da hoặc khi hít vào. Vì vậy phải sử dụng găng tay khi xử lý nó.
2.2. Phương pháp định lượng
Spoiler: click to toggle A. Phương pháp Quang Phổ U.V Nguyên tắc Aspartame được trích ly từ các viên kẹo bằng dung môi methanol và độ hấp thụ của dung dịch sau khi lọc được đo ở bước sóng 258 nm. Thuốc thử (I) Hỗn hợp dung môi: Trộn 350 ml nước với 150 ml methanol và để ổn định ở nhiệt độ phòng. (II) Dung dịch aspartame chuẩn: Chuyển 72 mg aspartame vào bình định mức 100 ml, thêm 50 ml hỗn hợp dung môi và lắc cho đến khi hòa tan hết, sau đó định mức đến vạch bằng hỗn hợp dung môi. Chuẩn bị mẫu Cân chính xác bột viên kẹo (đã được nghiền) tương đương với trọng lượng trung bình của 4 viên, cho vào một bình định mức. Thêm 50 ml hỗn hợp dung môi và lắc trong 30 phút. Sau đó định mức tới vạch bằng hỗn hợp dung môi. Lọc qua giấy lọc Whatman No. 1, loại bỏ 20 ml dịch lọc đầu tiên và thu lấy dịch lọc trong bình định mức. Quy trình Đo độ hấp thụ của dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu tại bước sóng 258 nm. Tính toán hàm lượng aspartame của viên kẹo từ độ hấp thu của mẫu và dung dịch chuẩn.
B. Phương pháp chuẩn độ dung dịch Nguyên tắc Aspartame từ dạng viên kẹo được trích ly với dimethylformamide, và dung dịch được chuẩn độ với lithium methoxide hoặc sodium methoxide chuẩn, với chất chỉ thị là thymol xanh. Hàm lượng Aspartame của mẫu được suy ra từ lượng thuốc thử tiêu tốn. Thuốc thử (I) Dung dịch lithium methoxide hoặc sodium methoxide (0.01N): Chuẩn hóa với axit benzoic chuẩn với chỉ thị thymol xanh. (II) N-N-Dimethyl formamide (DMF) (III) Chỉ thị thymol xanh: Chuẩn bị dung dịch 0,3% trong DMF. Quy trình Cân chính xác bột viên kẹo (đã được nghiền), tương đương với trọng lượng trung bình của 10 viên vào cốc thủy tinh 250 ml khô. Thêm 50 ml DMF và làm ấm trong chậu nước nóng. Để nguội và lọc vào bình tam giác 250 ml khô qua phễu thủy tinh. Tráng cốc và phễu bằng 50 ml DMF. Chuẩn độ với lithium / sodium methoxide 0.01N, sử dụng 5 giọt thymol xanh làm chất chỉ thị. Điểm cuối của quá trình chuẩn độ dung dịch có màu xanh đen.
3. ACESULFAME 3.1. Phân tích Acesulfame bằng sắc ký lỏng áp lực cao
Spoiler: click to toggle Thiết bị - Becker, pipet, bình. - Thiết bị sắc ký lỏng áp lực cao thích hợp với đầu dò UV 227nm, cột, Lichrosorb-RP 18 (10 μm). Thuốc thử - Pha động: Metanol : Nước (10 : 90), điều chỉnh hỗn hợp này ở 0,01M bằng cách sử dụng sulphate tetrabutylammonium. - Dung dịch chuẩn của acesulfame: 0.1 mg/ml trong nước cất. Điều kiện vận hành - Áp suất: 160 bar. - Lưu lượng: 40ml/h - Nhiệt độ thường - Thể tích mẫu: 10-20 µl. Chuẩn bị mẫu - Mẫu lỏng như nước trái cây: Lọc qua thiết bị lọc có kích thước lỗ 0.45 µm, và tiêm vào khoảng 10-20 µl. - Mẫu rắn: Khuấy mạnh 10mg mẫu với 100ml nước cất trong 30 phút và ly tâm. Cho dung dịch đi qua thiết bị lọc có kích thước lỗ 0.45 µm, loại bỏ những giọt đầu tiên, thu dịch lọc. Cách tiến hành Tiêm dung dịch chuẩn khoảng 5-20 µl và ghi lại các peak. Tính diện tích peak và vẽ một đồ thị hiệu chỉnh bằng cách sử dụng µg của chất so với diện tích peak. Tiêm dung dịch mẫu khoảng 10-20 µl và ghi lại diện tích peak của mẫu. Tính hàm lượng acesulfame của mẫu từ diện tích peak mẫu với đồ thị hiệu chỉnh.
3.2. Phân tích Acesulfame bằng HPLC
Spoiler: click to toggle Nguyên tắc Trích ly mẫu với nước hoặc dung môi giải hấp (nếu cần thiết), làm trong cột trích ly pha rắn hoặc thuốc thử Carrez, sắc ký HPLC đảo pha trên cột và phổ được xác định ở bước sóng 220nm. Thuốc thử - Acetonitrile - Metanol - Pot. dihydro photphat - Dipotassium hydrogen phosphate - Tetrabutyl ammonium hydrogen sulphate - Acid Phosphoric 85% (w/w) - Acid Phosphoric 5% (w/w). Hút 6ml acid photphoric (85%) cho vào bình định mức 100ml có chứa sẵn 80ml nước và pha loãng đến vạch. - Acid Clohydric 25% (w/w) - Dung dịch Carrez 1: Hòa tan 15 gm Kali hexacynoferat ( K4[Fe (CN)6] – 3 H2O) trong nước và pha loãng đến 100 ml. - Dung dịch Carrez 2: Hòa tan 30 gm kẽm sulphat (ZnSO4 .7H2O) trong nước và pha loãng đến 100ml. - Dung dịch đệm photphat II: KH2PO4 0.0125 mol / lít, pH = 3.5. Hòa tan 1,70 gm Kali hydrophotphat với 800 ml nước trong cốc 1000 ml. Điều chỉnh pH= 3.5 bằng acid photphoric. Chuyển dung dịch sang bình định mức 1000 ml và pha loãng đến vạch. - Dung dịch đệm photphat III – pH = 6.5: Hòa tan 5.46 g Kali hydrophotphat với 500 ml nước trong cốc 1000 ml, điều chỉnh về pH = 6.5 với dikali hydrophotphat khan. Thêm vào dung dịch 3.4 gm tetra butyl ammonium hydrogen sulphate và khuấy cho tan. Điều chỉnh pH về 6.5 bằng cách thêm dikai hydro photphat. Thêm 250ml methanol và điều chỉnh pH về 4.0 bằng vài giọt HCl (25%). Chuyển qua bình định mức 1000 ml và pha loãng đến vạch mức. - Pha động: Đệm photphat và acetonitrile hoặc methanol. Dung dịch đệm photphat sử dụng cho pha động, acetonitrile hoặc methanol tách riêng thông qua màng lọc thích hợp, kích thước lỗ 0.45 µm và đuổi khí khoảng 5 phút trong buồng siêu âm. Thêm cẩn thận đệm photphat và acetonitile đã xác định. Pha động phải sạch khi sử dụng. - Dung dịch kiểm tra chứa Acesulfame – K, natri saccharin và aspartame. Trong bình định mức 100 ml, cân 30 mg acesulfame – K, 20 mg natri saccharin, 200mg aspartame với độ chính xác 0.1 mg. Hòa tan và pha loãng đến vạch. Dùng pipet hút 20ml cho vào bình định mức 100 ml, pha loãng và định mức đến vạch. - Dung dịch Stock: Cân 100 mg acesulfame – K, 100 mg natri saccharin, 100 mg aspartame vào trong bình định mức 100ml. Hòa tan và pha loãng đến vạch mức. - Dung dịch chuẩn 1: Dùng pipet hút 10 ml dung dịch Stock cho vào bình định mức 100 ml, pha loãng đến vạch mức với nước. - Dung dịch chuẩn 2: Dùng pipet hút 5 ml dung dịch Stock cho vào bình định mức 100 ml, pha loãng đến vạch mức với nước. Dung dịch chuẩn 3: Dùng pipet hút 1ml dung dịch Stock cho vào bình định mức 100 ml, pha loãng đến vạch mức với nước. Thiết bị - Cân phân tích - Máy xay sinh tố áp lực cao hoặc thiết bị đồng hóa - Bình định mức với dung tích 100, 250, 500, 1000 ml. - Cốc 1000 ml - Pipet 1, 5, 10, 20, 25, 100 ml. - Micropipette 1000 µl. - Xylanh chia độ - Phễu - Giấy lọc rãnh - Bể nước - Buồng siêu âm - Máy ly tâm - Hệ thống khử khí - Màng lọc: kích thước lỗ 0.45 µm hoặc nhỏ hơn - Cột trích ly pha rắn : Sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC): được trang bị với đầu dò UV (có khả năng hoạt động ở bước sóng 220 nm), bộ phận ghi, hoặc tích hợp cho phép đo chiều cao và diện tích peak.
Cách tiến hành - Chuẩn bị dung dịch mẫu kiểm tra: Làm sạch các mẫu lỏng ( nước chanh, cola, các loại đồ uống): Pha loãng 20 ml chất lỏng trong bình định mức 100 ml với nước. Lọc dung dịch qua màng lọc có kích thước lỗ 0.2 µm trước khi tiêm. - Mẫu lỏng đục ( nước trái cây…): Pha loãng 20 ml mẫu với 50 ml nước trong bình định mức 100 ml. Thêm 2ml dung dịch Carrez 1, trộn lẫn với 2 ml dung dịch Carrez 2, pha loãng đến vạch mức với nước và lọc qua giấy lọc rãnh. Chuyển qua màng lọc có kích thước lỗ 0.45 µm trước khi tiêm. - Nếu chất béo tự do trong mẫu ban đầu vượt quá 3 mg thì khó hòa tan, nên phải thực hiện kết tủa và được ly tâm để làm trong dung dịch khoảng 10 phút trước khi lọc định lượng vào bình định mức 100 ml. Rửa lắng hai lần với nước và ly tâm lần nữa, lấy phần nổi trên mỗi bề mặt trong bình định mức 100 ml và pha loãng tới vạch với nước. - Mứt và các sản phẩm liên quan: Cân 20 mg mẫu đã đồng nhất (±0.1 mg) cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml nước và đặt bình trong buồng siêu âm ở 40oC khoảng 20 phút. Làm mát ở nhiệt độ phòng. Thêm 2 ml dung dịch Carrez 1, 2 ml dung dịch Carrez 2. Lắc mạnh và để yên trong 10 phút. Pha loãng đến vạch với nước. Lọc dung dịch qua giấy lọc rãnh, chuyển qua màng lọc có thước lỗ 0.45 µm trước khi tiêm. Thực hiện kết tủa, nếu chất béo tự do vượt quá 3mg, cần phải ly tâm để làm trong dung dịch khoảng 10 phút ở 1400 vòng/ phút. Rửa sạch với nước và ly tâm lại lần nữa như trong trường hợp của mẫu lỏng đục. - Sản phẩm rắn và bán rắn: Cân 10 – 20 mg mẫu đã đồng nhất cho vào bình định mức. Thêm khoảng 50 ml nước và đặt trong buồng siêu âm ở 40oC khoảng 20 phút. Làm mát ở nhiệt độ phòng, thêm 2 ml dung dịch Carrez 1 và 2 ml dung dịch Carrez 2, pha loãng đến vạch mức với nước và lọc qua giấy lọc rãnh. Trong trường hợp chất kết dính phức tạp, để bảo vệ cột phân tách thì việc sử dụng thêm cột trích ly pha rắn là cần thiết vì màu, mùi, chất béo không thể phân tách bởi dung dịch Carrez. Chuyển phần lọc được qua màng lọc có kích thước lỗ 0.45 trước khi tiêm. Thực hiện điều này đối với các chất kết tủa trên. - Custard Powder: Cân 10 mg mẫu cho vào bình định mức 500 ml. Thêm 400 ml nước và tiến hành như mô tả ở trên. Thêm khoảng 6 ml dung dịch Carrez 1 và 2 để lọc. Xác định: Cường độ chất tạo ngọt được xác định dựa vào thời gian lưu của chất phân tích trong dung dịch mẫu với chất tiêu chuẩn hoặc tiêm đồng thời dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu. - Tích phân diện tích các peak hoặc xác định chiều cao peak và so sánh các kết quả với giá trị tương ứng cho các chất tiêu chuẩn với diện tích peak gần nhất, cao hoặc sử dụng một đồ thị hiệu chuẩn. Kiểm tra độ tuyến tính của đồ thị hiệu chuẩn.
4. DULCIN 4.1. Phương pháp định tính
Spoiler: click to toggle Chuẩn bị mẫu Trích ly 100ml mẫu (mẫu đã được kiềm hóa với dung dịch NaOH 10%, hoặc kiềm hóa dung dịch nước chiết), chuẩn bị 3 mẫu x 50 ml diethyl ete. Chia hỗn hợp ete-dịch trích ly vào ba đĩa sứ lượng tương đương nhau, để cho dung môi bay hơi ở nhiệt độ phòng và sấy khô hỗn hợp còn lại. Cách xác định (a) Deniges – Tourrou Test: Làm ướt hỗn hợp đã sấy khô bằng acid nitric và thêm một ít nước. Nếu chất kết tủa màu đỏ cam chứng tỏ dulcin có trong mẫu. (b) Modified laparola-Mariani Test: phơi hỗn hợp đã thu được ở phần chuẩn bị để bay hơi khí HCl trong 5 phút và thêm vài giọt aldehide anisic. Nếu chất kết tủa màu đỏ máu chứng tỏ dulcin có trong mẫu. (c) Dimethylamino benzadehyde method: Hỗn hợp được thêm vài giọt đimethyl aminobenzaldehyde (1 gam hòa tan trong 10 ml HCl và được định mức đến vạch 100 ml). Nếu chất kết tủa màu đỏ chứng tỏ dulcin có trong mẫu.
4.2. Phương pháp định lượng
Spoiler: click to toggle UV- Spectrophotometric Method Nguyên tắc Dulcin trích ly từ mẫu đã chuẩn bị dưới điều kiện môi trường kiềm với đimethyl ete. Hỗn hợp sau khi loại bỏ dung môi được lấy đi bởi ethyl acetate. Dung dịch có khả năng hấp thu ở bước sóng 294nm. Thuốc thử (i) Diethyl ete (ii) Ethyl acetate (iii) Dung dịch NaOH 10% Cách tiến hành Chuyển 50 gam mẫu vào phễu chiết 250 ml và kiềm hóa mẫu bằng dung dịch NaOH 10%. Dịch chiết với 4 x 100 ml diethyl ete, lắc đều mỗi lần 2 phút. Làm sạch hỗn hợp trích ly với 10 ml nước và gạt bỏ lớp nước này. Dung môi bay hơi và sấy khô lương hỗn hợp còn lại ở 1100C trong 3 phút. Hòa tan hỗn hợp này với 50 ml ethyl acetate và chuyển vào bình định mức 100 ml, làm đầy đến vạch. Nếu cần thiết có thể pha loãng. Đo khả năng hấp thu bằng máy quang phổ ở bước sóng 294 nm. Xây dựng đồ thị hiệu chỉnh bằng mẫu chuẩn rồi dựa vào đó tính lượng dulcin trong mẫu.
5. CYCLAMATE 5.1. Phương pháp định tính
Spoiler: click to toggle A. Thử nghiệm natri nitrit Cách tiến hành Thêm 2 g bari clorua vào 100 ml mẫu hoặc dung dịch trích ly được chuẩn bằng cách nghiền mẫu, thêm nước để trộn hỗn hợp đều và đồng nhất. Thêm 2-5 g canxi clorua và lắc đều để hòa tan. Kiềm hóa bằng dung dịch NaOH 10%, lắc đều, và để yên trong vòng 2 giờ và lọc. Acid hóa dịch sau lọc bằng 10 ml dung dịch HCl và thêm 0.2 g NaNO2 ấm trên một tấm bản nóng. Có kết tủa trắng BaSO4 chứng tỏ có cyclamate trong mẫu.
B. Phương pháp sắc ký lớp bản mỏng (đồ uống) Nguyên tắc Đồ uống được trích ly bằng ethyl acetate, nồng độ chất trích ly tùy thuộc vào TLC trên silicagen và hiển thị vết. Saccharin, cyclamate, 5–nitro-2 propoxyaniline (P-4000) và dulcin được phát hiện. Thiết bị - TLC Apparatus - UV lamp (bước sóng ngắn – 254nm) Thuốc thử Chuẩn bị dung dịch mới trong ngày để sử dụng. - Dung môi cải tiến: n- butanol – alcohol – NH4OH – H2O theo tỉ lệ thể tích ( 40 + 4 + 1 +9) - Chất tạo màu: (i) Bromine trong CCl4 5 % (ii) 0.25 % fluoresein trong dimethyl formamide – alcohol theo tỳ lệ thể tích (1 + 1) (iii) 2 % N-1-Napthyl–ethylenediamine–2 HCl trong alcohol - Hỗn hợp chuẩn: 50 mg canxi cyclamate, 10 mg saccharin, 4 mg dulcin và 4 mg P–4000 trong 10 ml alcohol pha loãng tỉ lệ (1 + 1) 5 µl = 25 µg cyclamate, 5 µg saccharin, 2 µgdulcin, và 2 µg P–4000. Làm ấm dung dịch để hòa tan dulcin (nếu cần thiết), tránh kết hợp với P-4000. - Silicagen Chuẩn bị mẫu kiểm tra - Khử khí CO2 bằng cách lắc và rót nhiều lần. Lấy 50 ml mẫu cần kiểm tra cho vào bộ tách 125 ml, thêm cẩn thận 10 ml H2SO4. Làm lạnh, dịch chiết với 2x50 ml ete dầu hỏa (lắc nhẹ) và loại bỏ ete dầu hỏa. Lấy lớp nước dung dịch trích ly, cho thêm 5 ml dung dịch NaOH 50%, làm lạnh, và trích ly bằng ethyl acetate . Lọc dịch chiết ethyl acetate qua bông ethyl acetate đã rửa sạch cho vào cốc. Làm bay hơi 5 - - 10 ml trên bể hơi sử dụng không khí dòng và chuyển qua ống chia độ ( không được để dung dịch bay hơi đến khô trước khi chuyển qua, hỗn hợp có thể khó hòa tan lần nữa). Bay hơi dung dịch trong ống chia độ để khô trong bể hơi với không khí dòng. Pha loãng đến 2.5 ml bằng NH4OH–H2O–alcohol (theo tỉ lệ 5 + 5 + 10) và trộn đều. Các hỗn hợp không hòa tan trong ống dẫn sẽ không ảnh hưởng đến việc xác định. - Chuẩn bị các tấm bản và bể chứa: Cho 30 g bùn chưa lắng silicagel với 75 -80 ml nước và để tạo ra 5 tấm bản kích thước 20 x 20 cm, làm khô khoảng một giờ ở nhiệt độ phòng. Không được sấy trong lò, buồng sấy, không bảo quản trong tủ kín. Sử dụng các tấm bản này trong vòng 36 giờ sau khi chuẩn bị. - Bọc bên ngoài bể chứa là giấy thấm nước. Rót 25 ml dung môi cải tiến vào bể, làm ướt giấy. Đặt dung môi cải tiến lên 1 cm trong thùng. Đậy nắp thùng để yên một nữa giờ đến khi khí quyển trong thùng bão hòa. Xác định - Đánh dấu tấm bản TLC chỉ ở một biên, 2.5 cm từ chân để tạo dòng điểm. Đánh dấu chấm dòng 10 cm trên dòng điểm. Tổng cộng điểm trong 5µl mỗi hỗn hợp chuẩn và mẫu kiểm tra. Pha loãng phần mẫu kiểm tra đến 5 ml bằng hỗn hợp ammoniac- nước- alcohol (theo tỉ lệ 5 +5 + 10) và vết 5 µl. Đặt các điểm về một bên khoảng 2 cm và cách biên 2 cm. Đúng ở vị trí 1µl, sử dụng không khí ấm từ máy quạt thổi để làm khô giữa 2 điểm, dùng để giới hạn đường kính vết. Sử dụng kỹ thuật tương tự để kiểm tra phần vết và chuẩn (tổng thể tích của vết nên không quá 5 µl). - Đặt tấm bản trong thùng và tăng 10 cm dòng ( khỏang 1 giờ). Làm khô tấm bản trong tủ hút cho đến khi chiều dài lớp này không tăng nữa ( khỏang 10 phút). Quan sát dưới bước sóng ngắn 254 nm (UV). Vết của saccharin có đường bao phát huỳnh quang , vết có thể dạng lưỡi liềm nếu có một lượng lớn cyclamate trong mẫu. Trong tủ hút phun chất tạo màu 1 và 2 làm chậm sự hình thành dãy sáng ngay lập tức cho đến khi chuẩn cyclamate xuất hiện như một vết hồng ( khoảng 0.3 -0.40). P-4000 như một vệt nâu hồng ( khoảng 0.85). Tiếp tục phun bụi màu số 3 lên bề mặt tấm bản cho đến khi nền hồng mất dần chuyển sang vàng sáng. Độ tương phản của Cyclamate và P-4000 là tương đối khoảng 0.7 thì dulcin xuất hiện. Vết dulcin có thể là màu nâu hồng hoặc xanh tùy thuộc vào điều kiện của chất phun màu và độ cô đặc của chất tạo ngọt. Tấm bản có thể được phun chất tạo màu số 3 lại lần nữa để ghi lại độ tương phản nếu nền hồng xuất hiện lại lần nữa.
5.2. Phương pháp định lượng
Spoiler: click to toggle Nguyên tắc Cyclamate được thủy phân bởi acid dưới áp lực tạo thành cyclohexylamine, được chiết với chloroform và xử lý với ethanolic p-benzoquinone để tạo một sản phẩm màu và hấp thu ở bước sóng 473 nm. Thiết bị - Cốc thủy tinh có miệng rót, pipet, phễu chiết. - Nồi hấp: Hoạt động ở 15 psi ( 121 – 1250C) - Thiết bị đồng nhất. Thuốc thử (i) Cyclamate (muối Na hoặc Ca): Natri cyclamate hoặc canxi được sấy khô trong vòng 4 giờ ở 1000C. Chuẩn bị 1 mg/ml dung dịch bằng cách cân chình xác và hòa tan trong nước chưng cất ( dung dịch chuẩn) (ii) P-benzoquinone: Chuẩn bị 0.3% trong alcohol, chuẩn bị mới trước hi sử dụng. Cách tiến hành Đồng nhất mẫu (sử dụng thiết bị đồng nhất) và cân một lượng mẫu chính xác ( chứa khoảng 15-30 mg cyclamate) vào một cái cốc. Lấy một cái cốc khác, hút 10 ml dung dịch chuẩn. Pha loãng cả hai mẫu và chuẩn đến 40 ml bằng nước. Thêm 13 ml dung dịch HCl 6N và cuối cùng pha loãng đến 60 ml với nước. Đặt mỗi cốc bên trong khoảng 400ml, bên ngoài là kính đồng hồ và hấp trong vòng 7 giờ ở 15 psi ( 121 -1250C). Các biến đổi trong thủy phân có thể đạt được bằng cách thêm vào 5 ml HCl và 5 ml H2O2 30% để hòa tan mẫu và giữ cho bình trong bể nước sôi trong 2 giờ. Chuyển vào phễu chiết 250 ml, hiệu chỉnh pH 12.0 sử dụng NaOH 10 %, thêm một vài giọt vả dịch chiết với 3 x 25 ml chloroform. Dịch chiết chloroform được rửa kết hợp để dung dịch không bị kiềm hóa, sấy khan Na2SO4 và làm đầy đến vạch định mức 100 ml bằng chloroform. Hút lượng mẫu xác định và dung dịch chuẩn vào bình định mức 50 ml đặt trong bể nước 600C bảo quản trong vòng 2 giờ tránh ánh sáng trực tiếp. Làm lạnh, pha loãng đến thể tích và đọc độ hấp thu ở bước sóng 493 nm và tính toán hàm lượng cyclamate trong mẫu.
|